透明帶ZP2基因突變患者恐因「空濾泡综合症」導致不孕

透明帶(zona pellucida, ZP) 是包圍卵母細胞和植入胚胎的透明膠質結構(圖一)，其主要成分是醣蛋白。在卵子生成、受精和植入發育中起關鍵的保護作用。透明帶是由三種源自卵子所生成的蛋白質所組成，分別是ZP1、ZP2與ZP3。ZP2與ZP3的功能是用來辨識及結合精蟲，而ZP1則是做為支撐透明帶。在進行自然受精的過程中，精蟲會先與透明帶上的ZP3進行辨識，辨識後結合產生頂體反應(acrosome reaction )，使精蟲釋放出頂體酶來分解透明帶，進而使精蟲能夠穿入透明帶與ZP2結合。當首隻精蟲穿過透明帶接觸到卵母細胞時，卵母細胞將釋放皮質顆粒會引起透明帶發生結構變化，促使透明帶變硬形成保護機制，以此預防多重受精發生[1]。

圖一：卵母細胞被透明帶包圍，主要由ZP1、ZP2與ZP3蛋白組成，其功能包括調節配子相互作用中的物種特異性、預防多精症以及在植入前保護發育中的胚胎。

「空濾泡综合症」是女性不孕原因之一

「空濾泡综合症(empty follicle syndrome，EFS)」是一種不孕的成因，患者的月經週期、卵巢儲備量和基礎的賀爾蒙激素水平皆為正常，但是卻無法懷孕。在不孕症療程中，經由卵巢刺激後可發現濾泡發育，但無法從卵巢中取得任何卵母細胞。雖然「空濾泡综合症」的發生率極低，但是對於未來要面臨取不到卵的不良結局，對醫生和患者雙方都帶來極大打擊和壓力[2]。

先前的文獻結果說明ZP基因的突變與卵母細胞的透明帶缺陷有關。Dai等人在2019年研究發現，雙股ZP2基因突變會造成其部分或完全功能喪失，繼而影響ZP2蛋白表現，導致卵母細胞會有比較薄的透明帶[3]。2019年Zhou團隊發現了女性患者的ZP2基因突變 (c.1115G>C)，將造成多數卵母細胞無法形成透明帶[4]。然而，2020年Sun等人的文獻發表說明帶有單股ZP2基因突變而失去ZP2功能的女性，並沒有表現出生殖缺陷或是不孕[5]。在先前的研究中只知道ZP2基因突變與ZP蛋白受損所造成的不孕有關，並發現數個特異的基因突變位點與透明帶異常有關，但並不清楚其中成因與機制。、

透明帶基因突變導致取無卵母、卵丘細胞複合體

今年(2022)發表在《Human Reproduction》期刊的最新研究，作者找了三個無相關性的原發性女性不育家族，透過全外顯子定序技術 (Whole-exome sequencing) 檢測患者家族全基因體，確認是由染色體顯性遺傳模式造成不孕，且其家族中「空濾泡综合症」女性患者都有ZP2突變 (c.1925G>A, p.R642Q)。該女性帶有ZP2突變之患者具正常的月經周期、卵巢儲備和賀爾蒙水平; 超音波檢查也未發現子宮、卵巢和輸卵管具結構或形態上之異常。然而，該女姓患者於多次的不孕療程中，採卵當日都無法取得卵母細胞複合體 (cumulus-oocyte complexes, COCs)，僅發現少量的顆粒細胞 (granulosa cell)。隨後，使用組織染色觀察發育中卵巢濾泡的形態，發現其中含有卵母細胞存在，但其輪廓不規則、細胞質不均勻且和顆粒細胞的連接鬆散 (圖二)。進一步的免疫螢光染色，結果說明空濾泡综合症女性患者ZP2蛋白有異常地聚集在卵子細胞質的情形，且ZP1和ZP3蛋白也有同樣的情況。

此外，由於ZP2 p.R642Q突變位點位於ZP2蛋白的弗林蛋白酶切割位 (consensus furin cleavage site, CFCS)上。作者進一步證實了ZP2的p.R642Q變異會影響到ZP2的CFCS轉譯後修飾 (post-translational modification , PTM)，據此推測不完整的轉譯後修飾可能造成ZP2蛋白異常地累積於細胞質中。為了進一步研究ZP2的CFCS突變是否會對卵母細胞發育造成影響，作者利用小鼠實驗將合成的ZP2 p.R642Q 的cRNA注射到體外的未成熟卵母細胞內，在培養24小時後，卵母細胞有退化的情形，且細胞凋亡有增加的趨勢。且在免疫螢光染色結果顯示ZP2 p.R642Q突變的小鼠ZP2蛋白聚集在卵母細胞的細胞質中。作者說明ZP2 p.R642Q突變會使CFCS發生改變並導致ZP2於細胞質中異常堆積，進一步影響卵母細胞活性、於濾泡發育過程中大量死亡，造成「空濾泡综合症」並形成女性不孕。

深入且廣泛地暸解「濾泡综合症」形成之原因與機制，特別是相關基因突變之位點，可於臨床應用上可更精確、快速地協助患者判斷其不孕之成因，臨床醫師可進一步與患者討論並協助其進行適當的療程調整。由於「空濾泡综合症」女性患者的月經週期與賀爾蒙激素水平皆為正常，若可有適當之卵子來源，輔以適切之生殖技術，該疾病患者仍具懷孕生產之可能性(指接受捐贈卵子)。

圖二：從無相關的EFS病例中鑑定ZP2中的複發性雜合突變。

• (B)在光學顯微鏡檢查下卵巢刺激後EFS患者的顆粒細胞和正常對照組的卵母細胞。比例尺，100μm。
• (C)EFS患者及正常對照組卵巢組織免疫組化染色。黑色箭頭表示正常ZP，紅色箭頭表示 ZP缺失或有缺陷。比例尺，50μm。
• (D)EFS患者和正常對照者卵巢組織的透射電鏡圖像。箭頭表示正常 ZP，紅色箭頭表示ZP 缺失或有缺陷。雙虛線表示ZP的邊界，單虛線表示 Oo 和顆粒細胞之間的邊界。比例尺，2μm。

(EFS:空濾泡綜合徵；Oo:卵母細胞； ZP:透明帶)


 

文獻參考：

1. Dun M, Mitchell L, Aitken R, Nixon B. Sperm-zona pellucida interaction: molecular mechanisms and the potential for contraceptive intervention. Handb Exp Pharmacol. 2010;(198):139-78.
2. Coulam CB, Bustillo M, Schulman JD. Empty follicle syndrome. Fertil Steril 1986;46:1153–1155.
3. Dai C, Hu L, Gong F, Tan Y, Cai S, Zhang S, Dai J, Lu C, Chen J, Chen Y et al.  ZP2 pathogenic variants cause in vitro fertilization failure and female infertility. Genet Med 2019b;21:431–440.
4. Zhou Z, Ni C, Wu L, Chen B, Xu Y, Zhang Z, Mu J, Li B, Yan Z, Fu J et al.  Novel mutations in ZP1, ZP2, and ZP3 cause female infertility due to abnormal zona pellucida formation. Hum Genet 2019;138:327–337.
5. Sun Y, Zeng Y, Chen H, Zhou Z, Fu J, Sang Q, Wang L, Sun X, Chen B, Xu C. A novel homozygous variant in ZP2 causes abnormal zona pellucida formation and female infertility. J Assist Reprod Genet 2021;38:1239–1245.
6. Shen Y, Guo J, Zhang X, Wang X, Zhu S, Chen D, Xiong W, Lu G, Liu X, Dai C, Gong F, Wang Y, Lin G, Wang Z, Xu W. Identification of a heterozygous variant of ZP2 as a novel cause of empty follicle syndrome in humans and mice. Human Reproduction, Volume 37, Issue 4, April 2022, Pages 859–872.